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    人工核酸內切酶介導的新一代基因組編輯技術進展

    2015-06-10 11:40 | 作者: 肖安 張博 | 標簽: 基因組編輯

    張博,北京大學生命科學學院教授。1989年畢業于北京大學生物學系,1995年獲北京大學博士學位,1997–2002年在瑞士蘇黎世大學從事博士后研究,隨后回到北京大學任教至今。曾作為訪問學者赴美國威斯康星大學和加州大學洛杉磯分校進行學術交流。曾獲中國高??茖W技術獎一等獎和國家自然科學二等獎。目前以斑馬魚為模式從事細胞增殖分化與器官形成的遺傳與分子機制研究,同時致力于發展多種遺傳學技術。在NatureBiotechnology、PLoSBiology、PNAS等國際學術期刊發表多篇學術論文。

    摘要:對基因組特定位置進行針對性修飾的實驗方法稱為基因組編輯技術。近年出現的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas等一系列人工核酸內切酶逐漸形成了新一代基因組編輯技術,極大地促進了基因組靶向修飾技術的發展,并在基因功能研究、基因治療等領域開始發揮巨大作用。文中對這一技術的基本原理、發展歷程和應用方式進行了簡要總結。

    遺傳學的核心任務之一是闡釋基因及其產物的功能,其發展經歷了經典遺傳學、現代遺傳學和功能基因組學等三大重要階段。遺傳學最重要的研究策略之一為獲取突變體以及對突變體進行基因型、表型分析,除此之外,轉基因、RNAi以及其他特異性激活或抑制基因表達的方法也是遺傳學研究中的常用技術。獲取突變體的途徑主要包括篩選天然突變體、人工隨機誘變(正向遺傳學手段),以及針對基因組上特異位點進行靶向修飾(反向遺傳學手段)等。其中,能夠實現對基因組進行定點誘變的反向遺傳學方法是解讀基因功能最直接、也是最具有挑戰性的手段之一。這一研究思路一方面基于對基因組、轉錄組高通量測序所提供的信息,另一方面則嚴重依賴于基因組編輯技術的發展。

    在相當長的時期內,絕大多數生物體或體外培養細胞中缺乏有效的基因組靶向編輯技術手段,僅有的基于胚胎干細胞和同源重組等少數可行方案存在效率非常低、具有嚴格的物種局限性等缺點,這也在很大程度上制約了功能基因組研究的進程。隨著DNA測序技術的飛速發展,完成全基因組序列測定的物種數量呈現爆發式增長,而基因組定點突變技術的瓶頸所帶來的功能基因組研究的滯后效應也越發明顯??蒲泄ぷ髡咂惹行枰环N簡單、有效的基因打靶技術來解讀記載在每一個基因組中的生命的奧秘。近幾年,人們巧妙地利用細菌的一些特殊的基因表達調控機制,以及多年來對轉錄因子作用機制的研究成果,逐步創建出能夠根據人們的意愿特異切割DNA靶序列的人工核酸內切酶(Engineeredendonuclease,簡稱EEN),并借此在理論上實現了對任意物種/基因組的任意位點進行靶向修飾的夢想。該項技術的核心思路是針對目標位點(基因組上特定的DNA序列)設計并通過基因工程的方法構建特定的核酸內切酶,使其能夠特異識別、結合并切割該靶序列,從而在基因組的特定位點造成DNA雙鏈斷裂(Doublestrandbreak,簡稱DSB),最終利用細胞自身的DNA損傷修復的容錯性造成靶位點序列產生突變。目前EEN主要包括鋅指核酸酶(Zincfingernuclease,ZFN)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)、規律性成簇間隔的短回文重復序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)及相關蛋白(CRISPR-associated,Cas)系統(CRISPR/Cas系統)等3種類型。這種基于人工核酸酶的新型基因組編輯技術原理簡單、操作簡便,在應用上對物種或細胞沒有選擇性,因此迅速成為擁有極其廣泛發展前景和應用價值的熱門研究領域之一。由于該項技術在思路上不同于傳統的以胚胎干細胞為基礎的基因打靶策略,并且在實用性和適用性上均產生了質的飛躍,因此筆者認為不妨借用對新型DNA測序技術的命名,將基于EEN的基因組靶向突變技術稱為“新一代”基因組編輯技術。下面簡單總結、比較EEN以及EEN介導的基因組靶向修飾的類型,并簡單展望該項技術的發展前景。

    1人工核酸內切酶的類型與比較

    1.1ZFN

    圖 1 三種人工核酸內切酶的基本結構與組成

    ZFN是3種人工核酸內切酶中最早被開發并投入應用的。人們很早就了解到,生物體中存在多種鋅指蛋白(Zincfingerprotein,ZFP),它們的共同特點是包含數量不等(通常為3–7)的鋅指基序(Zincfingermotif),這些鋅指能夠介導蛋白質與核酸、小分子或其他蛋白質的特異相互作用。相當一部分ZFP能夠特異識別并結合基因組DNA上特定長度序列的靶位點,從而作為轉錄因子對基因表達進行調控。ZFN技術即利用了這一特性。通過人工改造鋅指序列(常用的是C2H2類型的鋅指)中對識別并結合DNA靶位點產生重要作用的幾個關鍵位置的氨基酸殘基,通過基因工程的方法組裝出識別特定靶位點的ZFP結構域,并和一個能夠非特異切割DNA的核酸酶結構域(造成DNA單鏈或雙鏈斷裂)融合,便可得到有可能特異切割靶位點的ZFN。通常選擇的切割結構域來自FokI核酸內切酶,它需要在靶序列的下游以二聚化的形式行使切割DNA的功能。因此,在具體應用中,通常需要構建一對ZFN單體,聯合使用。每個ZFN含有3個鋅指單元,可識別9bp的靶序列(每個鋅指單元大致識別3個堿基)。兩個靶序列分別位于DNA上相反的兩條鏈上,并相距特定的間隔(圖1A)。1996年,首個人工合成的ZFN被成功報道可在體外實現對靶序列的切割。2002年,ZFN首次成功應用于個體水平,在果蠅中實現了基因的定點突變。隨后數年,這一技術的應用范圍被擴充到多種生物體和培養細胞中,從而為很多模式生物開創了反向遺傳學研究的新天地。

    遺憾的是,ZFN技術在實際應用中存在很多問題。首先,對于ZFP與DNA的識別與結合規律人們了解得并不透徹。人工構建的ZFN和ZFP通常由多個鋅指組裝而成,但是每個鋅指對其靶序列的識別與結合的能力和特異性受上下文(周邊的鋅指單元)的影響非常大,并且相鄰的鋅指之間存在著交錯影響。經過多年研究,人們對于ZFN與其DNA靶序列的相互作用僅了解到非常有限的一些關聯性,例如富含G的靶序列更容易獲得有效的ZFN等,因而無法直接根據所需要識別的靶序列構建相應的ZFN。因此,為了獲取一對能夠有效工作的ZFN,往往需要測試或篩選數量非??捎^的鋅指序列組合庫,不但需要消耗相當大的人力物力,而且最終的成功率也不高。同時,ZFN的誘變效率整體而言比較低(在生物體中很多時候不超過10%。此外,ZFN還存在較高的脫靶效應(Off-targetingeffect),即除了切割指定的靶位點,往往還會切割基因組上其它具有相似序列的位點。人們嘗試過多種方法改進ZFN的特異性,例如,通過突變FokI上特定的氨基酸殘基得到多種FokI變體,其中有些FokI變體只有形成異源二聚體時才能組成有活性的內切酶復合體,這樣就可以部分減少脫靶效應。但是,總體而言ZFN的特異性仍然不高。上述這些局限性無疑大大增加了ZFN使用的難度。不少研究組開發了各種ZFP/ZFN的構建與篩選方案,以期能夠解決這些問題。但總體而言,這一技術的應用門檻相當高,一般只有少數商業公司才有一定的把握篩選出具有一定靶點識別與切割效率的鋅指組合及其ZFN。正在大家一籌莫展之際,TALEN和CRISPR/Cas系統相繼“從天而降”,這才真正掀起了基因組編輯技術的一場革命。

    1.2TALEN

    TALEN的基本原理和ZFN類似,也是由特異識別靶序列的DNA結合結構域和FokI切割結構域融合而成,只是由特異性較強的TALE結構域替代了ZFP。TALEN的DNA結合結構域來自于Xanthomonas屬植物病原菌表達的一種類轉錄激活因子(Transcriptionactivator-likeeffector,TALE)。TALE包含多個(通常為12-35)串聯的重復單元(稱為TALErepeat),各個單元的長度(通常為33-35個氨基酸殘基)和序列骨架非常相似,僅第12位和第13位的兩個氨基酸殘基存在著高度可變性,稱為重復可變雙殘基(Repeatvariabledi-residue,簡稱RVD)。2009年,通過統計分析和實驗測試,兩個研究組同時揭示了TALE重復單元的生物學功能——每個單元對應識別靶基因上的一個DNA堿基,是一種全新的DNA結合結構域。此外,在識別并結合靶位點方面,TALE重復單元相互之間基本沒有影響,而且所有能夠識別4種堿基的單元都已發現。僅僅1年后,人們就證明由TALE和FokI融合得到的TALEN能夠對靶位點進行特異切割與高效突變(圖1B)。TALE重復單元與靶位點這種精確的一一對應關系極大方便了研究者的使用,從而免除了ZFN應用中大規模的篩選工作。TALEN對靶位點序列的要求也非常寬松,僅需要在靶序列5'端上游的第一個堿基為T即可。同時,TALEN的切割與誘變效率雖然也存在難以預測并且有時變動較大等問題,但平均而言相對于ZFN要高很多。針對不同的位點,TALEN的活性/突變效率差異可以很大,在生物體中從無活性到突變效率接近100%都有可能。例如,在斑馬魚中,有將近3/4的位點TALEN的突變效率可達1%以上,有1/4的位點的效率可高于50%(本實驗室未發表數據)。此外,目前的研究結果顯示,TALEN的特異性非常好,脫靶效應要比ZFN低得多(有可能與其識別區域長度很長有關)。這些特性使得TALEN技術迅速發展起來,在很多領域取代了ZFN的應用。

    TALEN技術應用的難點是TALEN表達載體的構建。TALE結構域比較大,可達600–800個氨基酸殘基(1800–2400bp編碼序列),并且序列高度重復,難以使用常規的PCR、酶切連接等分子克隆技術實現。多個研究組運用不同的思路和工具,開發了各種構建TALE和TALEN蛋白表達載體的方法,從而使得這一技術能夠為更多的人使用。

    1.3CRISPR/Cas系統

    與ZFN和TALEN不同,CRISPR/Cas并非基于與DNA結合的轉錄因子修改而成,而是借鑒了多種原核生物和古核生物中天然存在的一套獲得性免疫系統。細菌能夠捕獲入侵的病毒、質粒等外來核酸序列片段,并將其嵌入到其基因組中一段高度串聯重復并帶有特定回文結構的區域(CRISPR)。這一區域能夠被轉錄、切割形成具有特定二級結構的小片段RNA(稱為CRISPRRNA,crRNA)。若細菌被帶有同一序列的外來核酸感染,這些crRNA可在CRISPR相關蛋白(Cas)和其他RNA(tracrRNA)的輔助下,以堿基配對的方式特異性識別外源入侵序列,并通過各種不同的作用機制組裝形成核酸酶切割復合物,降解入侵的核酸。利用這一特性,2012年,通過改造機制研究得最為清楚、組成最為簡單的II型CRISPR/Cas系統(僅由一個Cas9蛋白、一段人工構建的帶有20nt識別序列的crRNA和另一個序列通用的tracrRNA組成),人們在體外成功實現對攜帶有同樣的20bp序列的DNA雙鏈靶位點特異切割。同時,作者還進一步簡化了這個系統,將兩個RNA分子通過一段連接序列合二為一,并且去除了不必要的區域,設計出一個長度為102nt的RNA分子,稱為向導RNA(GuideRNA,gRNA;也有文獻稱為單一向導RNA,singleguideRNA,sgRNA),并發現Cas9-gRNA的組合同樣也能夠實現對DNA的靶向切割(圖1C)。因此,CRISPR/Cas系統又稱Cas9/gRNA系統。半年后,兩個研究小組使用人工構建的CRISPR/Cas系統成功地在包括iPS細胞在內的多種體外培養的人類細胞中實現了對基因組特定位點的切割與誘變,從而開創了這一新技術在活體中的應用。

    與ZFN和TALEN相比較,CRISPR/Cas系統不是通過蛋白與核酸的相互作用,而是通過核酸與核酸之間的堿基互補配對作用來識別并結合靶序列,這使其原理和操作更為簡單。CRISPR/Cas系統要求的靶位點序列規則也僅需要在識別區域的3?端下游的3個堿基為NGG。在實際應用中,對于不同的靶位點,只需改變gRNA,而Cas9蛋白則都是相同的,無需重新設計與構建;而負責識別不同靶序列的gRNA的長度則非常短,可以通過多種方式在體外快速合成或快速構建體內表達系統。由此可見,CRISPR/Cas系統在應用的簡便性上具有巨大的優勢。此外,還可以構建多個gRNA,與Cas9共同導入生物體或細胞內,這樣就有可能實現對多個靶位點的同時切割與突變。目前來看,CRISPR/Cas系統對靶位點的切割及誘變效率與TALEN大致相當,不過,該系統對靶位點的選擇性仍有待深入研究。

    作為一種最新的基因組靶向誘變技術,CRISPR/Cas系統目前存在的一個最值得關注的問題應該是其潛在的脫靶效應。目前看來,至少有兩方面的因素會影響到該系統的特異性。一方面涉及到靶序列的長度。CRISPR/Cas系統以單一復合體的形式起作用,其識別的靶位點的長度固定為20bp,短于一對TALEN通常所聯合識別的30–40bp。更重要的影響因素涉及到其識別靶序列的機制——堿基互補配對往往會表現出一定的容錯性。有報道表明,在人類細胞系中某些CRISPR/Cas存在著相當可觀的脫靶切割效率,這些脫靶效應很可能是由于堿基錯配所導致的。有研究組設法突變Cas9蛋白,將其改造為只能切割一條DNA單鏈的核酸缺刻酶(Nickase)Cas9n,從而可以像ZFN和TALEN一樣使用一對識別相反鏈的Cas9n/gRNA組合實現雙鏈切割,以增加靶位點的序列長度。結果發現這一方式可以降低脫靶效應。為了避免或減量減少堿基錯配造成的脫靶效應,部分提供靶位點設計的網絡在線工具也增加了預測潛在脫靶位點、以供用戶選擇特異性較高的gRNA的輔助功能??傮w而言,關于CRISPR/Cas系統潛在脫靶效應的問題尚需進一步的研究和探索。

    ZFN、TALEN、CRISPR/Cas系統的簡要發展歷程和比較如下(圖2、表1)。
    2借助人工核酸內切酶技術的基因組定點修飾方法

    各種人工核酸內切酶所主要解決的問題都是針對染色體/基因組上所設計的靶位點實現特異切割、造成DSB。而借助于DSB對基因組進行靶向編輯主要包括以下3種策略。

    2.1單DSB導致的indel突變

    非同源末端連接(Non-homologousendjoining,NHEJ)是細胞自發修復DSB造成的DNA損傷的一種主要方式。細胞內的DNA發生DSB后,各種修復因子和作用復合物可將斷裂產生的兩個DNA末端直接連接起來。這一連接過程常常不是完全精確的,而是往往會可能發生小片段的缺失和/或插入(Smallinsertion/deletion,indel)。如果indel破壞了基因的讀碼框或提前引入翻譯終止位點,那么就有可能破壞基因的功能和/或表達,造成該基因產生突變。在實際應用過程中,這一策略只需將人工核酸內切酶引入到生物體或培養細胞后,不需要進行其他操作,等待適當的時間后對indel誘變效率進行檢測即可。

    大部分已報道的人工核酸內切酶的應用均使用的是NHEJ-indel誘變策略。這一方法所得到的突變等位基因的類型不可控制,因此絕大多數情況下只能對基因進行功能破壞性突變操作。在應用這一策略的時候,需要注意所選擇的靶位點應該位于基因編碼區比較靠前的外顯子中(但是要在翻譯起始密碼子ATG之后),并且最好在編碼某個重要功能結構域的序列之前,這樣突變后才能使整個蛋白失去正常作用。同時需要注意可變剪接、多重轉錄本,以及潛在的下游可選翻譯起始位點等問題,盡量選在確定能夠完全破壞整個基因功能的區域。

    2.2雙DSB介導的基因組大片段刪除NHEJ-indel策略只能應用于單個蛋白編碼

    基因,對于希望破壞非編碼RNA基因、基因組順式作用元件(調控序列)、多個基因、多個轉錄本、多個剪接變體,或基因簇等情況,或是針對較大的或情況比較復雜的蛋白編碼基因,包括希望去除某些特定的功能結構域等,indel往往難以達到預期目的。這時可以同時使用兩組/兩對人工核酸內切酶,使其分別識別基因組上兩個不同的位點,在間隔一定距離的DNA雙鏈上造成兩個DSB,這樣就有可能在NHEJ介導的修復連接時,將兩個位點兩側的序列直接連接起來,而丟掉兩個DSB之間的區段。這樣獲得的突變類型屬于大片段的缺失突變(Largefragmentdeletion)。刪除片段的長度可長可短,有的甚至可長達百萬堿基對(Mbp)。

    這一策略最初在人類細胞中報道,隨后在其他物種中也得到了應用,可順利實現對miRNA簇的刪除等。不過,大片段刪除的效率顯著低于單點indel的突變效率,而且還會隨著兩個位點之間的距離增大而進一步下降。

    2.3同源重組介導的基因組精確修飾同源重組(Homologousrecombination,HR)


    或同源介導的修復(Homologydirectedrepair,HDR)是傳統上在小鼠中應用的基因組定點修飾方法。通過引入兩側各帶有一段和靶位點序列一致的同源臂(Homologousarm)的外源供體(Donor)DNA,細胞染色體能夠以很低的效率(約10–6量級)與供體DNA發生同源同組,從而將外源序列精確地置換到基因組中。由于天然發生的同源重組的效率太低,因此往往需要通過在供體DNA上添加正、負篩選標記并優化條件,并且篩選足夠多的細胞,才有可能在眾多細胞株中找到成功發生同源重組的細胞。因此,這一方法很難在缺乏有效篩選策略的生物體中實現。

    曾有過報道,在同源重組靶位點附近造成雙鏈斷裂或單鏈缺刻可極大地提高重組效率。因此,人工核酸內切酶技術出現后,人們便開始嘗試用它提高HR的效率,以便在整體動物水平實現對基因組的精確修飾。結果表明,在同源重組的目標序列附近設計人工核酸內切酶造成DSB后,能將細胞中的重組效率提高3-4個數量級,極大地方便了篩選工作。同時,在很多傳統上無法實現同源重組的物種中(如斑馬魚),使用人工核酸內切酶定點切割也順利實現了外源序列的精確整合。

    同源介導修復的最大特點是可以精確地操控和編輯基因組,借此可以實現精確的點突變(Pointmutation)、基因修復(Genecorrection)、基因敲入(Geneaddition)、基因替換(Genereplacement)等,從而在疾病治療、基因標記、特殊突變體構建等領域發揮重要作用。需要注意的是,人工核酸內切酶介導的同源重組效率仍然大大低于單點indel效率,同時兩者之間還存在競爭關系,需要在重組供體上設計一些可供篩選的序列或其他分子標記。

    3人工核酸內切酶應用前景與展望

    目前,對于這3種EEN,ZFN基本上已經完全被TALEN代替,TALEN則跟CRISPR/Cas系統并存,兩者各有千秋。TALEN的優勢是特異性高,脫靶效應較低;CRISPR/Cas系統的優勢則是使用簡便、成本低。不過,由于兩者真正應用的時間都很短,TALEN技術建立迄今不過3年,CRISPR/Cas系統體系則僅一年多,因此都存在一些問題有待深入研究。例如,兩種基因打靶體系都依然需要優化,應用范圍與方式需要進一步拓展,作用機制仍有待深入研究;TALEN的成功率與靶點效率預測、CRISPR/Cas系統的成功率與特異性/脫靶效應、毒性與安全性等都有待進一步評估與優化。什么樣的位點能夠獲得較高的突變效率?CRISPR/Cas系統的特異性/脫靶效應究竟如何?這些問題仍有待謹慎探索。

    展望未來,這一技術至少會在以下幾個領域中發揮越來越廣泛而重要的作用:

    1)對模式生物基因組的操控。借助于EEN,對任意模式生物的基因組進行定點編輯已經由夢想逐漸變成了現實,反向遺傳學研究方法也得到了飛躍式的發展。這一方法使得不少傳統上缺乏反向遺傳學工具的模式物種(例如斑馬魚、大鼠)的基因功能研究工作的難度大大降低,也節省了已有其他基因定點突變工具的模式物種的突變體構建時間(例如小鼠、果蠅),同時還為很多以前研究不夠充分的物種提供了幾乎是唯一的可用工具(包括很多靈長類和眾多非傳統模式物種在內)。

    2)在體外培養細胞中的應用。利用人工核酸內切酶,可同樣有針對性地操作、編輯體外培養細胞的基因組。由于CRISPR/Cas工具極其容易應用的特性,特別是其gRNA可以高通量構建,有研究人員已經開始著手構建人類細胞全基因組的靶向gRNA庫,相信在不久的將來就可以實現大規模的、全基因組范圍的正向或負向選擇性功能篩選。

    實際上,這場革命不僅使模式生物和體外培養細胞的研究受益,而且必將產生更深遠的影響。我們有理由樂觀地憧憬,大眾化的EEN技術很有可能會像當年的分子克隆、PCR技術一樣進入最普通的實驗室,成為任何一個涉及到核酸研究的實驗室必備的常規工具。

    3)在疾病基因治療方面的應用。通過特異性修飾基因組的特定序列,人工核酸內切酶技術為基因治療帶來了新的希望。將這項技術跟iPS等干細胞技術相結合,其應用前景更是不可限量。這方面的工作目前主要集中在體外培養的人類細胞中,相關的嘗試包括使用ZFN破壞T細胞內HIV入侵至關重要的受體蛋白CCR5、使用TALEN介導的HDR原位修復鐮刀形紅細胞貧血癥、地中海貧血癥、隱性營養不良性大皰性表皮松解(Recessivedystrophicepidermolysisbullosa,RDEB)等相關致病基因等。這方面由于ZFN發展歷史較長,對其細胞毒性、脫靶活性等方面的研究也較為充分,因此目前在這個領域暫時走在前面。筆者相信,在不久的將來,TALEN和CRISPR/Cas系統會奮起直追,在這一領域大顯身手。同時,由于這一領域對于脫靶效應的要求會格外嚴格,因此,CRISPR/Cas系統更需要在這方面充分研究和分析論證。

    4)在經濟物種中的應用。將人工核酸內切酶應用于經濟動物(家禽家畜)或經濟植物(農作物)無疑也是一個非常令人期待的方向。通過特異性編輯和調控與家畜、作物相關性狀有關聯的基因,可實現對抗病、抗逆、產量、品質、生長條件等方面的性狀改良,有可能大大縮短育種周期,并且實現精準育種。目前,在豬、牛等大型家畜和家蠶、煙草、玉米等多種培養動植物中均已有相關的嘗試和報道。跟疾病治療方面的應用類似,這方面的應用也要特別注意安全性、脫靶活性等問題。此外,由于涉及到基因操作,EEN技術為傳統的轉基因作物的安全性評估與管理帶來了新的挑戰,同時,也為此帶來了新的思路和出路。

    EEN的應用絕不僅限于上述4個領域。例如,EEN技術還可以用于通過基因組修飾的途徑改造寵物的形態、行為等特征,使其更加多樣化、更貼近人類的需求等??傊?,EEN技術既為生命科學基礎理論研究,又為跟人類健康與生活密切相關的經濟物種改良和人類疾病治療帶來了全新的方法和希望。正是由于預見到其強勁的發展勢頭,TALEN和CRISPR/Cas系統分別被美國《科學》雜志評為2012年度和2013年度的十大科學進展之一,TALEN被譽為“基因組巡航導彈”(Genomiccruisemissiles),CRISPR/Cas系統則被譽為“大眾化的基因組微型手術刀”(Geneticmicrosurgeryforthemasses)。一個全新的技術出現僅僅一年之后,馬上又被另一個更新的技術所超越,回首各種生命科學研究技術的發展,這樣的例子可以說在歷史上絕無僅有。最后,一個令人感興趣的懸念是:CRISPR/Cas系統是這項技術的終極版本嗎?還會有更簡便的工具和/或方法出現嗎?讓我們拭目以待。(參考文獻略)

    來源:《生物工程學報》

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