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    利用基因組編輯技術創制水稻白葉枯病抗性材料

    2018-06-14 17:54 | 作者: 郝巍 紀志遠 鄭凱麗 孫宏達 王福軍 唐永超 張明偉 趙開軍 王春連 | 標簽: 基因編輯 水稻白葉枯病

    摘要:水稻白葉枯病是最重要的水稻細菌性病害,嚴重威脅水稻生產和糧食安全。培育和種植抗白葉枯病水稻新品種是控制該病害最經濟、有效、環保的技術手段。W6023是本課題組早期通過普通野生稻與IR24雜交創制的抗病基因導入系,前期轉錄組測序結果顯示,Pong2?1(Os02g20780)和Pong11?1(Os11g14160)在感病親本IR24中激活表達,在抗病導入系W6023中不表達。Pong2?1和Pong11?1是水稻中Pong類轉座子最相似的兩成員,DNA同源性超過90%,但轉錄本卻存在明顯差異。為研究Pong2?1和Pong11?1是否與IR24的感病性相關,本研究利用CRISPR/Cas9系統定點突變IR24的Pong2?1和Pong11?1位點,獲得了多個突變株系,毒力測試結果顯示Pong2?1和Pong11?1突變后IR24的抗性得到一定提高,創制出6個抗白葉枯病水稻材料。


    水稻白葉枯病菌收錄于我國《進境植物檢疫性有害生物名錄》,是重要的檢疫對象。Xoo從水稻葉片的葉尖或葉緣水孔處侵入,在細胞間隙增殖,隨后進入維管束組織并利用維管束在植物體內轉移擴散。Xoo在侵染水稻過程中,通過多種途徑將數量眾多的毒性因子分泌到胞外或者轉運到宿主細胞內,例如III型分泌系統效應蛋白。這些毒性因子靶向多個水稻靶點,通過抑制植物防衛反應或攫取養分,達到利于病原菌增殖和傳播的目的。例如,Xoo中類轉錄激活效應因子靶向的水稻感病基因主要是SWEET糖轉運蛋白家族基因(包括OsSWEET11、Os?SWEET13和OsSWEET14)。Xoo引起水稻的白葉枯病,嚴重威脅到水稻生產和糧食安全。BB發生時一般會給水稻造成20%~30%的減產,嚴重情況下可達50%~60%,甚至絕產。

    長期的生產實踐證明,培育和利用水稻抗病品種是控制此病害最有效、最經濟也是最環保的手段。但是隨著病原物的不斷進化和生態條件惡化帶來的生物多樣性減少,可利用的抗病育種資源愈來愈少??共』蛲诰蚨鄰囊延锌共≠Y源中獲得,如野生稻資源、地方特色品種等,這些資源應用于育種需要通過不斷雜交和回交才能將抗病基因整合到現代水稻品種中,所需時間長,且存在遺傳累贅等利用困難現象。利用外源基因整合到受體品種基因組中即轉基因育種也是一種獲得優良性狀的手段,但是外源基因在受體基因組的定點整合問題至今沒有解決,而外源基因在受體基因組的隨機插入不僅可能導致外源基因的表達在某些位點受阻,而且可能導致受體基因組的某些有益基因失活,因而降低了獲得理想轉基因個體的效率,以及目前的轉基因植物常常面臨生物安全問題等。
    基因組編輯技術的問世,為創制生物資源及育種利用提供了新途徑。目前,基因組編輯技術主要包括鋅指核酸酶、類轉錄激活效應因子核酸酶以及CRISPR/Cas9,3種編輯技術。ZFNs體系的構建難度較大、成本高,目前只成功應用于人類干細胞、大鼠、煙草等少數生物體的基因組編輯。在作物改良上,只有一例利用該技術對玉米性狀進行改良的報道。與ZFNs相比,TALENs載體的構建相對簡單、成本也大幅度降低,此技術迅速被應用起來。例如,利用該技術對感病水稻效應子結合元件位點進行突變達到了規避PthXo1、AvrXa7、Tal5、TalC等TALEs毒力的目的,使水稻感病品種產生了抗病的效果。繼TALENs技術后,國際上又出現了基因組定點編輯的CRISPR/Cas9技術,該技術憑借著成本低廉、操作方便、效率高等優點,被迅速應用于人類、動物和植物等的基因組編輯。例如,F.Wang等針對稻瘟病負調控基因進行定點編輯,獲得了稻瘟病抗性明顯提高的水稻材料。M.Li等對水稻產量相關基因進行定點修飾,發現每穗實粒數、粒長都明顯增加。Y.Wang等對水稻基因DEP1進行定點突變,突變后使水稻材料植株變矮,籽粒密度、產量增加。Y.Zhang等對小麥3個負調控同源基因TaEDR1進行定點編輯,提高了小麥對白粉病的抗性。J.Shi等對玉米一個乙烯響應的負調控因子ARGOS8進行編輯,在干旱條件下,突變體的抗旱性顯著高于野生型。J.Li等對水稻OsEPSPS基因定點替換,獲得的突變體對草甘膦具有抗性。目前,CRISPR/Cas9技術在農作物的各種性狀改良上得到了廣泛的應用。

    本課題組前期對病原菌誘導下的IR24和野生稻基因導入系W6023進行了轉錄組測序分析,比較基因表達的差異,發現一個在W6023中幾乎不表達而在感病供體IR24中高表達的基因Os02g20780和Os11g14160,推測這2個基因可能與感病相關。本研究旨在利用CRISPR/Cas9技術對IR24開展定點突變,檢測定點編輯后的水稻材料是否產生抗病性。這一研究將對探討水稻白葉枯病感病機理提供依據,也為水稻育種提供新的抗病資源。

    1材料與方法

    1.1供試水稻材料

    本研究使用的水稻材料:水稻白葉枯病廣譜感病品種IR24,野生稻基因導入系W6023,IR24的編輯植株。所有材料于2015年12月至2017年10月分別種植在海南三亞市南濱農場中國農業科學院作物科學研究所南繁基地和中國農業科學院作物科學研究所網室(北京),常規水肥管理。

    1.2供試菌株與接種方式

    水稻白葉枯病菌代表菌株PXO99A接種前從-80°C冰箱取出,在PPS培養基28°C培養48h,以無菌水配制接種菌液,濃度調至OD600=1.0。幼苗期水稻材料(5~6葉)采用注射方法接種,收集樣品、提取RNA用于基因表達分析。用于表型鑒定分析的水稻材料在成株期采用人工剪葉接種法接種鑒定,分別在接種后7d、15d進行調查。

    1.3水稻DNA提取

    采用S.R.McCouch等報道的酚/氯仿抽提法提取水稻基因組DNA。

    1.4水稻RNA提取及反轉錄

    水稻材料總RNA的提取采用Trizol法。取適量RNA用DNaseI(2270A,購自寶生物工程(大連)有限公司)消化殘留的DNA后,使用RNA純化試劑盒(DP412,購自天根生化科技(北京)有限公司)純化。取2μg總RNA使用反轉錄試劑盒(KR106,購自天根生化科技(北京)有限公司)合成cDNA。

    1.5基因克隆

    根據日本晴基因組信息設計Pong2?1、Pong11?1克隆引物分別為Pong2?1F:ATGAATCCGACG?GAATCGAAGAAGCGTC;Pong2?1R:TCAATTATCTT?TAGCAAACAAAGCCAAT和Pong11?1F:ATGAATCT?GACGGAATCGAAGATGCGTC;Pong11?1R:CTATAG?TATTGAACTTTCTCTAAGATCA。PCR反應體系為20μL:2×PCRMasterMix10μL、正反向引物各1μL、cDNA模板1μL(35ng)、Nuclease?Free水補齊到20μL。反應程序為:95°C30s;95°C10s,52°C20s,72°C60s,40個循環?;蚩寺〖拜d體構建時采用高保真KODFX酶(Toyobo,日本)并測序,轉基因植株陽性檢測及基因剪切分析等用普通Taq酶擴增。

    1.6水稻突變體的構建和檢測

    本研究構建IR24Pong轉座子突變體時,采用華南農業大學劉耀光實驗室提供的pYLCRISPR/Cas9Pubi?H載體,首先將接頭引物(靶點1F:GGCACCGGCAGCCTGATTGGATT;靶點1R:AAA?CAATCCAATCAGGCTGCCGG;靶點2F:GCCGTCG?GCTCCCACAACACTAG;靶點2R:AAACCTAGTGT?TGTGGGAGCCGA)94°C加熱30s,室溫自然冷卻退火,然后與對應的sgRNA載體連接,將含有不同靶位點的sgRNA通過PCR擴增形成含有多個靶位點的gRNA表達盒,詳細步驟參見X.Ma等。本試驗采用農桿菌介導的水稻遺傳轉化技術。

    1.7亞細胞定位

    用特異引物擴增基因編碼序列,克隆到pCAM?BIA1205?YFP上,電擊轉入農桿菌EHA105中。30°C培養箱中過夜培養菌液,4000r/m離心收集菌體,緩沖液重懸菌體濃度調節到OD600=1.0,室溫靜止3h。采用1mL注射器吸取菌液,注射本氏煙葉片后,人工氣候室培養2~3d。將注入菌液部分的葉片用手輕輕撕下,用熒光染料DAPI(特異性細胞核染色試劑)對本氏煙葉片進行染色處理。使用LSM7000激光共聚焦掃描顯微鏡(蔡司)觀察蛋白在細胞中表達的位置。

    2結果與分析

    2.1Pong2?1、Pong11?1的轉錄表達分析

    W6023經過多輪回交后在遺傳背景上與IR24很接近,為了探究W6023與IR24水稻白葉枯病抗性差異原因,本實驗室前期通過RNA?Seq分析了在PXO99A誘導情況下的兩個材料轉錄組之間的差異。結果顯示,Pong類轉座子成員Os02g20780(Pong2?1)和Os11g14160(Pong11?1)在IR24中均有表達,但是在W6023中幾乎沒有表達。為了驗證轉錄組測序的結果,本研究通過RT?PCR檢測了Pong2?1和Pong11?1的表達情況,結果表明RT?PCR和RNA?Seq分析結果一致(圖1)。



    依據日本晴基因組信息,水稻攜帶有超過100個Pong類轉座子成員。在DNA水平上Pong2?1和Pong11?1是最接近的兩個成員,序列同源性超過90%(結果未顯示)。由于Pong2?1和Pong11?1間存在單核苷酸多態性,基因組預測Pong2?1和Pong11?1的RNA剪接形式存在差異(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。為了明確這兩個Pong類轉座子成員轉錄本的真實情況,嘗試克隆日本晴、IR24和W6023的Pong2?1與Pong11?1的cDNA并測序(圖1),結果顯示Pong2?1、Pong11?1在日本晴和W6023中均未檢測到有表達,但在IR24中有表達并表現為不同的兩種剪接體形式。

    2.2Pong11?1的序列分析與亞細胞定位

    克隆得到Pong2?1、Pong11?1全長cDNA后,測序分析發現Pong2?1編碼190個氨基酸,Pong11?1則編碼一個398個氨基酸的蛋白。二者與日本晴的序列也存在一定差異,差異的原因是SNP導致兩種剪接體形式不同。為了研究Pong類轉座子蛋白在細胞中的定位,選取Pong11?1作為研究對象??寺ong11?1全長cDNA,連接到pCAMBIA1205?YFP載體后轉化農桿菌GV3101。通過注射煙草,利用農桿菌瞬時表達系統,激光共聚焦顯微鏡觀察到融合蛋白在細胞中的位置,如圖2A~D顯示YFP?Pong11?1在本氏煙葉片表皮細胞的細胞核中表達。H為空載體YFP的定位結果,其表達分布在整個下表皮細胞(圖2E~G)。通過煙草瞬時表達系統表明Pong11?1編碼一個核蛋白。

    2.3基因編輯載體構建及遺傳轉化

    由于發現Pong2?1、Pong11?1僅在IR24中表達,為了驗證其表達是否對水稻感病起作用,利用CRISPR/Cas9系統對IR24中的Pong2?1、Pong11?1進行定點突變。由于Pong2?1、Pong11?1DNA同源性高,設計了針對這兩個基因的共同gDNA(圖3),選擇了2個靶位點(圖3A)。參照X.Ma等的方法構建成含有雙靶位點的CRISPR表達載體pCponT12(圖3B)。




    2.4T0代轉基因植株的PCR檢測

    將上述CRISPR/Cas9載體pCponT12通過農桿菌介導法轉入IR24的愈傷組織中,經篩選分化獲得20個T0代植株,種植于海南試驗基地。為了驗證其是否為真正的轉基因植株,根據Cas9基因DNA的序列,設計了一對基因特異引物Cas9pF/Cas9pR(Cas9PF:TTCGACCAGTCCAAGAACGG,Cas9pR:CTT?GACCTTGGTGAGCTCGT),對上述20株的DNA進行PCR擴增。20株轉化體都能擴增出531bp的DNA特異性條帶,而陰性對照IR24無擴增條帶(圖4)。結果表明20株轉基因植株全部為陽性植株。



    2.5編輯植株的基因型鑒定及抗性檢測

    隨機選取部分T1代進行Pong2?1、Pong11?1位點基因型鑒定,測序結果顯示,在5個T1代群體中,檢測到在Pong2?1、Pong11?1位點發生編輯突變的植株,而且都是雙靶點突變,大部分植株的突變位點基因型已純合,5個群體中共檢測到6種編輯類型如圖5。對這6種編輯類型的植株進行了白葉枯病抗性測定,選取的測試菌株為PXO99A。接種15d后調查,每個編輯類型選取5株,每株選取3個葉片,進行調查統計。6種編輯類型植株病斑平均長度在6.94~8.71cm之間,而IR24發病長度為14.85cm(圖6)。結果表明Pong2?1、Pong11?1編輯植株對水稻白葉枯病菌(PXO99A)表現出一定程度的抗性增強。





    2.6Cas9?free編輯植株的獲得與農藝性狀考察

    為了獲取可利用的Cas9?free水稻抗性資源,利用Cas9基因特異引物Cas9pF/Cas9pR檢測6種編輯類型的T2代單株,從中選取PCR檢測陰性植株作為后續試驗研究材料(圖7)。田間再次接種試驗顯示接種7d后,IR24平均發病長度為2.81cm,而Z223、Z229、Z235和Z255平均發病長度分別為0.67cm、0.88cm、0.69cm和0.75cm。接種15d后病斑有擴展,IR24發病長度為15cm,而Z223、Z229、Z235和Z255平均發病長度分別為7.51cm、8.69cm、7.34cm和8.31cm(圖8A、B),可見編輯植株病斑長度仍顯著小于IR24的病斑長度。









    為了研究編輯植株主要農藝性狀是否發生改變,對上述4個Cas9?freeT2純合株系的主要農藝性狀進行了考察。從表1可看出,4個材料的株高、分蘗數、結實率和千粒重與野生型對照(IR24)基本一致;4個材料的T檢驗分析結果顯示上述農藝性狀與野生型對照無顯著性差異?;虮痪庉嫼髮λ镜闹饕r藝性狀無顯著影響,最終本研究獲得了白葉枯病抗性提高、Cas9?free及農藝性狀基本一致的種質材料。



    3討論

    植物———病原物之間的斗爭是寄主與病原菌協調進化的過程,植物病原物為自身的生存和發展會利用多種手段侵入寄主并攫取養分,造成植物病害的發生,而寄主植物主要利用自身的先天免疫系統應對不斷變化的病原菌。植物的先天免疫系統可以分為兩個層次,PTI和ETI。PTI主要是植物模式識別受體識別某些保守的病原物模式分子,例如FLS可以識別細菌鞭毛蛋白的保守短肽,誘導防衛反應產生,限制病原物的入侵。為成功侵染寄主,植物病原物會利用各種效應分子來抑制PTI,例如Xoo來源的T3SS效應分子XopY通過抑制OsCERK1對OsRLCK185的磷酸化阻止了PTI的信號轉導。同時寄主植物也會進化出R基因監控、識別病原菌某些效應蛋白,一旦被識別即會觸發強烈的免疫反應ETI,例如Xa23基因通過啟動子EBE區識別Xoo的TALEAvrXa23蛋白,作物抗病育種利用的也大多是這類R基因,植物———病原物互作的特點決定了植物抗病育種是一項沒有終點的工作。
    現階段挖掘得到的和已被利用的白葉枯病抗病基因有很多,例如Xa3、Xa4、xa5、Xa21和Xa23等,但由于R基因的不合理使用和病原菌的高速進化,一些優秀抗病基因在生產上逐步喪失作用。粳稻大多利用的Xa3基因,在孟加拉、印度、尼泊爾、印度尼西亞、韓國及中國的南方等地區,含有Xa3基因的品種遭受到病原菌的危害。章琦研究表明,大面積種植的秈型雜交稻中主要應用了抗白葉枯病基因為Xa4,曾使白葉枯病得到了有效的控制。但到20世紀80年代中期,在中國南方各稻區及印度、印度尼西亞、韓國、尼泊爾等國也相繼發生了攜有Xa4基因的品種抗性逐漸喪失的報道。Xa21基因自鑒定克隆以來,由于各國爭相利用在一些國家和地區如韓國、印度尼西亞、印度、中國的廣東、云南等地發現能使攜Xa21基因的宿主致病的菌系。夏立瓊等發現的海南Xoo菌株優勢致病類型對攜帶xa5、Xa23基因以外的材料都致病。因此育種家對水稻白葉枯病抗性資源的需求越來越迫切,挖掘和創制新抗病資源依舊是水稻白葉枯病防治工作重要的方面?;蚪M編輯技術的問世為創制基因資源提供了新途徑,尤其是CRISPR/Cas9系統具有簡單、高效、低成本的特點,在人類、動物和植物上得到了廣泛的應用。例如,用該技術對水稻、小麥、玉米、柑橘等某些負調控基因進行了基因編輯,這些性狀在不同程度上得到了改良,獲得了抗病、抗逆性材料。

    為了充分利用W6023這一抗病資源和研究其抗病特征,前期研究采用強致病菌PXO99A接種處理IR24和W6023后,對不同時間點的樣品進行轉錄組測序,分析在不同致病表型下IR24和W6023材料表達差異。RNA?Seq發現Pong類轉座子在感病品種IR24中激活表達,但在野生稻導入系W6023中不表達。有研究發現玉米Pong類轉座子在體外培養或者某種壓力下會被激活表達,并且被認為對玉米基因組的進化起到貢獻。我們推測Pong類轉座子可能與IR24的感病性有關聯,IR24是對多種病原物均感病,包括水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌和水稻稻瘟病菌;與野生稻03?66雜交后,導入系W6023抗性明顯增強,Pong類轉座子的兩個成員也不再表達,暗示病原菌脅迫解除后該類轉座子轉錄被抑制,W6023基因組趨于穩定。由于Pong2?1和Pong11?1在IR24中高表達,本研究采用CRISPR/Cas9技術對IR24的Pong2?1和Pong11?1進行了敲除,獲得了多個純合株系,田間接種試驗顯示基因編輯株系的抗性得到不同程度的提高,編輯后的主要農藝性狀無顯著影響,最終獲得了白葉枯病抗性提高、Cas9?free及農藝性狀基本一致的種質材料。但IR24抗病性差是否與基因組穩定性有聯系,Pong轉座子的表達是否增加了IR24的感病性,還需開展更深入的研究。 

    來源:《植物遺傳資源學報》2018,19(3):523?530

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